کروماتوگرافی

هدف آزمایش:کروماتوگرافی کاغذی

وسایل آزمایش: لوله موئین ، بشر  ، استوانه ی مدرج،مزور، شیشه ساعت.

تئوری :  

کروماتوگرافی اصطلاحی است که به چندین تکنیک جداسازی اطلاق می گردد که اساس این روش ها مهاجرت افتراقی یا اصطلاحا(Defferential Migration) است .دراین تجربه یکی ازاین روشهایعنی کروماتوگرافی کاغذی به منظور جداسازی مخلوطی از یون های فلزات واسطه به کار می رود به طوری که شناسایی آن ها ممکن شود .خواهید دید که شناسایی هر یون پس از این که این یون هااز هم جدا شدند خیلی راحت تر خواهد بود .

درهر روش مهاجرت افتراقی سه چیز مورد نیاز است.

۱)      بایستی یک محیط مهاجرت وجود داشته باشد که محلی است برای این که جدا سازی اتفاق بیافتد.

۲)      بایستی یک نیروی جلو برنده (Driving Force)برای حرکت دادن گونه ها جهت جدا شدن در طول محیط مهاجرت وجود داشته باشد.

۳)      بایستی یک نیروی مقاوم انتخابی (Selection Resistive Force)وجود داشته باشد.

تعریف نیروی متحرک (Driving Force): عبارتست از تمایل حل شدن گونه در فاز متحرک که باعث پیشروی سریع تر نمونه می شود.

تعریف نیروی مقاوم انتخابی(Selection Resistive Force): عبارتست از تمایل حل شدن گونه در فازثابت که باعث عقب ماندن آن از مهاجرت می شود.

همین نیروی اخیر یعنی نیروی مقاوم انتخابی است که باعث جدا سازی قابل ملاحظه گونه های شیمیایی می شود.

اگرمخلوط از گونه های شیمیایی روی یک محیط مهاجرت درنقطه ای قرارداده شوند ،نیروی جلوبرنده تمایل دارد که مخلوط را به مکانی دور تر از نقطه شروع حرکت دهد .از طرفی نیروی مقاوم انتخابی تمایل به عقب نگه داشتن گونه ها دارد .نیروی مقاوم مذکور از این نظر انتخابی است که حرکت هریک از گونه هارا با میزانی متفاوت کند می کند.

این اختلاف در سرعت حرکت در جهت دور شدن از مبداء،اساس اصطلاح (Defferential Migration) است.

دراین آزمایش روش مهاجرت افتراقی ،کروماتوگرافی کاغذی است . محیط مهاجرت نواری از کاغذ کروماتوگارفی است. نیروی جلوبرنده ،جریانی از مایع به عنوان حلال در طول نوار کاغذ است که این حلال مایع ،فاز متحرک یا (Mobile Phase)هم گفته می شود .درمورد نیروی مقاوم انتخابی این احتمال می رود که بیش از یک نوع نیروی مقاوم انتخابی درکاغذ کروماتوگرافی وجود داشته باشد. شاید یکی از نیروهای مقاوم انتخابی عمده وقتی شناخته شد که دریافتند کاغذ دارای مقدار زیادی آب است که محکم به آن چسبیده واین وضع ممکن است به صروت استخرهایی از آب تصور شود .وقتی گونهه های شیمیایی درحال حرکت در طول مسیر فاز متحرک هستند با مکان هایی پر از آب پیوند یافته به کاغذ مواجه می شوند .حتی ممکن است این گونه ها به داخل این فاز ثابت یا ساکن (Stationary Phase)حرکت کنند نظربه این که کسری از زمان که هر گونه جدا گانه ،درفاز ساکن سپری می کند بستگی به حلالیت نسبی آن گونه درهر دو فاز ساکن ومتحرک دارد واین حلالیت ها بستگی به ماهیت گونه شیمیایی دارد واین مسئله یک عمل مقاوم انتخابی را توصیف می کند .وقتی یک گونه درفاز متحرک است ،با سرعتی معادل سرعت فاز متحرک حرکت می کند .وقتی گونه درفاز ساکن است این چنین حرکتی ندارد .بنابراین گونه های شیمیایی مختلف در یک نمونه معین به علت این که باسرعت های متفاوتی درجهت ددور شدن از مبدا حرکت می کنند جدا می شوند.

واضح است که برای یک زوج معین از فازهای ساکن ومتحرک ،کسری ازفاصله که گونه شیمیایی طی می کند یسبت به فاصله ای که فاز متحرک طی می کند ثابت خواهد بود. این کسر که مقدار Rf گونه مورد نظر نامیده می شود ،ممکن است به منظور مقایسه دو کورماتوگرام مورد استفاده قرارگیرد هرچند که ممکن است فازمتحرک دردو کروماتوگرام به اندازه های متفاوتی پیشروی کرده باشد.

هرچند که کروماتوگرافی با کاغذ ،وسیله توانایی برای جدا سازی گونه های شیمیایی است اغلب گونه ها ری کروماتوگرام قابل رویت نیستند .به این دلیل اغلب لازم است کروماتوگرام را با واکنشگرهایی که با گونه هایی شیمیایی مورد نظر واکنش داده وترکیبات رنگین تولید می کنند اثر دهیم .

تاریخچه

برای اولین بار در سال ۱۹۰۵ میلادی چوگایف دانشمند روسی واکنش دی‌متیل گلی‌اکسیم با یون نیکل را کشف کرد

و از آن برای شناسایی و اندازه‌گیری یون نیکل استفاده نمود. ولی توسعه واقعی و سریع واکنشگرهای آلی و استفاده از آنها در شیمی تجزیه از سال ۱۹۴۵ میلادی شروع شد. علت آن نیز گسترش صنایع نوین و اهمیت تجزیه مقادیر جزئی در این صنایع بود.

طبقه‌بندی واکنشگرهای رسوب دهنده:

واکنشگرهای رسوب دهنده معدنی

مواد معدنی که محلول آنها برای رسوب دادن یونهای فلزی بکار می‌روند عبارتند از اسیدهای معدنی ضعیف یا قوی نظیر H2S,H3PO4,H2SO4,HCl یا نمکهای محلول آنها. اسید سولفوریک و سولفات هیدروژن یونها را به صورت سولفید رسوب می‌دهند، اسید سولفوریک برای رسوب دادن یون باریم و اسید هیدروکلریک برای رسوب دادن یون نقره استفاده می‌شود.

هیدروکسیدهای محلول نظیر سدیم و پتاسیم و آمونیاک برای رسوب دادن یونهای فلزی به صورت هیدروکسید بکار می‌روند. همچنین از یونهای فلزی هم می‌توان به عنوان عامل رسوب دهنده آنیونهایی که با آنها رسوب کم محلول می‌دهند استفاده کرد.

واکنشگرهای رسوب دهنده آلی

واکنشگرهای آلی در شیمی تجزیه کاربردهای فراوان دارند. از این واکنشگرها در وزن سنجی ، تیترسنجی ، روش قطره‌ای و جذب سنجی استفاده می‌شود. واکنشگرهای رسوب دهنده آلی دارای عواملی هستند که بوسیله آنها مولکول واکنشگر با یونهای معدنی ترکیب می‌شود و این عوامل بیشتر خاصیت اسیدی دارند.

سیر تحولی رشد

اولین روش‌های کروماتوگرافی در سال ۱۹۰۳ بوسیله میخائیل سوئت ابداع و نام گذاری شد. او از این روش برای جداسازی مواد رنگی استفاده کرد. مارتین و سینج در سال ۱۹۵۲ به پاس اکتشافاتشان در زمینه کروماتوگرافی جایزه نوبل دریافت کردند.

توصیف کروماتوگرافی

کروماتوگرافی را به دلیل اینکه در برگیرنده سیستمها و تکنیکهای مختلفی است نمی‌توان به طور مشخص تعریف کرد. اغلب جداسازی‌ها بر مبنای کروماتوگرافی بر روی مخلوطهایی از مواد بی‌رنگ از جمله گازها صورت می‌گیرد. کروماتوگرافی متکی بر حرکت نسبی دو فاز است ولی در کروماتوگرافی یکی از فازها بدون حرکت است و فاز ساکن نامیده می‌شود و دیگری را فاز متحرک می‌نامند. اجزای یک مخلوط به وسیله جریانی از یک فاز متحرک از داخل فاز ساکن عبور داده می‌شود. جداسازی‌ها بر اساس اختلاف در سرعت مهاجرت اجزای مختلف نمونه استوارند.

روش‌های کروماتوگرافی

روش‌های کروماتوگرافی را می‌توان ابتدا بر حسب ماهیت فاز متحرک و سپس بر حسب ماهیت فاز ساکن طبقه‌بندی کرد. فاز متحرک ممکن است گاز یا مایع و فاز ساکن ممکن است جامد یا مایع باشد. بدین ترتیب فرآیند کروماتوگرافی به چهار بخش اصلی تقسیم می شود. اگر فاز ساکن جامد باشد کروماتوگرافی را کروماتوگرافی جذب سطحی(Adsorption Chromatography) و اگر فاز ساکن ، مایع باشد کروماتوگراف تقسیمی(Partition Chromatography) می‌نامند.

مزیت روشهای کروماتوگرافی

با روشهای کروماتوگرافی می‌توان جداسازی‌هایی را که به روش‌های دیگر خیلی مشکل می‌باشند انجام داد. زیرا اختلافات جزئی موجود در رفتار جزئی اجسام در جریان عبور آنها از یک سیستم کروماتوگرافی چندین برابر می‌شود‌. هر قدر این اختلاف بیشتر شود قدرت جداسازی مواد بیشتر و برای انجام جداسازی مواد نیاز کمتری به وجود اختلافات دیگر خواهد بود. مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که نسبتا آسان می‌توان به آن دست یافت با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد ولی یک جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد. یکی از مزایای برجسته روش‌های کروماتوگرافی این است که آنها آرام هستند. به این معنی که احتمال تجزیه مواد جداشونده به وسیله این روش‌ها در مقایسه با سایر روش‌ها کمتر است. مزیت دیگر روش‌های کروماتوگرافی در این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است به این دلیل روش‌های تجزیه‌ای مربوط به جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند. روش‌های کروماتوگرافی ساده سریع و وسایل مورد لزوم آنها ارزان هستند. مخلوط‌های پیچیده را می‌توان نسبتا به آسانی به وسیله این روش‌ها به دست آورد.

مواد	نوع کروماتوگرافی
مواد شیمیایی مشابه	کروماتوگرافی تقسیمی
مواد شیمیایی غیر مشابه	کروماتوگرافی جذب سطحی
گازها و اجسام فرار	کروماتوگرافی گازی
مواد یونی و معدنی	کروماتوگرافی تبادل یونی در ستون کروماتوگرافی کاغذی یا لایه نازک الکترفورز ناحیه‌ای
مواد یونی و غیر یونی	کروماتوگرافی تبادل یون یا ژلی
مواد زیستی و ترکیباتی با جرم مولکولی نسبی بالا	کروماتوگرافی ژلی الکتروفورز

انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی

انتخاب نوع روش کروماتوگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی مواد گازها) عموما تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی جهت پیش بینی بهترین روش برای جداسازی مواد اجسام مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روش‌های ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می‌شوند. زیرا این روش‌ها در صورتی که مستقیما قادر به جداسازی مواد نباشند نوع سیستم کروماتوگرافی را که جداسازی مواد بوسیله آن باید صورت بگیرد، مشخص می‌کنند آنگاه در صورت لزوم از روش‌های پیچیده‌تر استفاده می‌شود. از فهرست زیر می‌توان به عنوان یک راهنمای تقریبی استفاده کرد‌ در جداسازی‌های مشکل وقتی که روش‌های ساده فاقد کارایی لازم هستند روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HELC) می تواند جوابگو باشد.

کروماتوگرافی کاغذی (Paper Chromatography)

اطلاعات اولیه

انواع جداسازی‌های مختلف و ساده بر روی کاغذ به عنوان پیشروان کروماتوگرافی کاغذی توصیف شده‌اند. این سیستم معمولا به عنوان نمونه بارزی از سیستم تقسیمی در نظر گرفته می‌شود که در آن فاز ساکن آب است و به وسیله جذب سطحی بر روی مولکول‌های سلولز قرار می‌گیرد و مولکول‌های سلولز نیز به نوبه خود به وسیله ساختار الیافی کاغذ در وضعیت‌های ثابت نگه داشته می‌شود. امروزه ، به هر حال ، مشخص شده است که جذب سطحی اجزای فاز متحرک و حل شونده‌ها و اثرات تبادل یون نیز نقش‌هایی را ایفا می‌کنند و کاغذ به هیچ عنوان تنها به صورت تکیه گاه بی اثر نیست.

سیر تحولی رشد

روش پیشنهادی رانگ در سال ۱۸۵۰ و فرآیندی که آن را تجزیه موئینه‌ای می‌نامند، از جمله آنها می‌باشند. چنین روش‌هایی در واقع بیشتر شبیه کروماتوگرافی جذب سطحی بودند و کروماتوگرافی کاغذی به مفهوم فعلی ، گسترش سیستم تقسیمی است که به وسیله مارتین و سینج در سال ۱۹۴۱ ارائه شد. در سال ۱۹۴۴ کونسدن ، گوردن و مارتین اسیدهای آمینه و پپتیدهای موجود در محصول آبکافت ، پروتئین پشم را به وسیله روشی جدا کردند که در آن به جای ستون پودر از یک صفحه یا نوار کاغذی آویزان در داخل یک ظرف سرپوش‌دار استفاده شده بود.

خصوصیت ویژه

یک خصوصیت ویژه روش کروماتوگرافی کاغذی این است که چیزی مربوط به محلول یا گاز خارج شده از ستون که در سیستم‌های معمول مایع یا گاز با آن برخورد می‌کنیم وجود ندارد. ترکیبات جدا شده روی کاغذ مکان‌یابی و شناسایی می‌شوند در نتیجه ، جداسازی به طور نسبتا دائم در روی کاغذ ثبت می‌شود. در این روش اجزای جدا شده جمع آوری نمی‌شوند و احتیاجی به وسایل پیچیده کنترل پیوسته نیست. اندازه گیری کمی ترکیبات جدا شده را می‌توان روی کاغذ انجام داد ولی اگر بخواهند اجرای را از کاغذ خارج کنند. تنها کار لازم این است که قسمت مربوط به هر یک از اجسام را از کاغذ ببرند و هر یک را به طور جداگانه بشویند. وقتی که جبهه حلال مسافت مناسبی را طی کرد یا بعد از یک زمان از قبل تعیین شده ، کاغذ را از طرف بیرون آورده ، جبهه حلال را با علامتی مشخص می‌کنند و می‌گذارند تا صفحه خشک شود. وقتی که محل‌های مناطق جدا شده آشکار شدند لازم است که هر یک از اجسام به طور جداگانه شناسایی شوند. در موارد ایده‌آل ، هر جسم با واکنشگر مکان‌یاب ، رنگ مخصوصی می‌دهد که در مورد مواد معدنی بیشتر و درمورد مواد آلی کمتر مشاهده می‌شود. ساده‌ترین روش شناسایی بر اساس مقدار Rf یعنی نسبت فاصله طی شده به وسیله جبهه حلال است.

نقایص کروماتوگرافی کاغذی

لکه‌های چند تایی :در کروماتوگرافی یون‌ها فلزی ، اگر دارای آنیونی متفاوت از آنیون موجود در محلول اولیه باشد، ممکن است رقابتی بین آنیون‌ها برای یون فلزی وجود داشته باشد، که در نتیجه دو لکه به دست می‌آید که هر یک از آنها مربوط به یکی از نمکهای فلزی می‌باشد. ممکن است یون فلزی دو کمپلکس متفاوت با حلال ایجاد کند. در جدا سازی‌های آلی ، ممکن است جسم دو شکل متفاوت وجود داشته باشد. به عنوان مثال یک آمینو اسید می‌تواند به صورت کاتیون و یون دو قطبی باشد.

دنباله دار شدن:اگر مخلوط یه مقدار زیاد از حد روی کاغذ قرار داده شود، یا سرعت عبور حلال متفاوت باشد، جسم نمی‌تواند برای ایجاد یک لکه مجزا به تعادل برسد. در این صورت این لکه ، در سطح بزرگی از کاغذ پخش شده و از حلال در حال پیشروی عقب می‌ماند. دنباله‌دار شدن ممکن است به سبب اثرات جذبی سطحی تر ایجاد شود.

اثرات لبه یا کناره: لکه‌ها خیلی نزدیک به کنار نوار ، ممکن است در امتداد کنار کاغذ پخش شوند، عمل نفوذ ممکن است به علت بالا بودن غلظت موضعی فاز متحرک در آن ناحیه ، و یا به علت بالاتر بودن سرعت تبخیر حلال در کنار کاغذ ، که منجر به اثرات تقسیمی غیرعادی می‌شوند، باشد.

 روش کمی کروماتوگرافی کاغذی

کاربرد کمی این روش نه تنها احتیاج به یک جداسازی کمی ، بلکه مکان‌یابی و ارزیابی کمی اجسام موجود نیز دارد. یک جداسازی کیفی رضایت بخش ، الزاما برای کار کمی مفید نیست. اندازه گیری کمی را می‌توان یا با سنجش مقدار جسم موجود در لکه روی کاغذ ، یا با خارج کردن جسم از کاغذ و تجزیه اجزای جدا شده به وسیله روش‌های کمی متداول انجام داد. لکه اولیه از نمونه مناسب روی کاغذ قرار می‌دهند، خشک کردن لکه باید تحت شرایط استاندارد زمان و دما صورت گیرد.

در تهیه حلال باید دقت زیادی روی نسبت‌های اجزای صورت گیرد، برقرار ساختن تعادل باید به طور استاندارد انجام گیرد، طول عبور حلال در تمامی نوبت‌ها یکسان باشد، در طول آزمایش ، دما باید ثابت بماند، و خشک کردن ورقه باید در یک زمان و دمای استاندارد انجام گیرد. واکنشگر مکان‌یاب (در صورت استفاده از لکه‌های رنگی) باید به طریق کاملا تکرارپذیر افزوده شود. و هر عمل بعدی ، مانند خشک کردن یا قراردادن در معرض بخار آمونیاک ، باید در مدت استاندارد انجام گیرد. مقدار جسمی که در یک جداسازی کروماتوگرافی باید روی کاغذ قرار گیرد، متغیر است.

موارد استعمال کروماتوگرافی کاغذی

منابع علمی مربوط به روش‌های تجزیه‌ای و بررسی ترکیبات طبیعی نشان می‌دهد که کروماتوگرافی کاغذی در هر رشته‌ای کاربرد دارد. با این همه ، این روش هنوز هم در جداسازی‌های مواد با ماهیت زیستی وسیعترین کاربرد را دارد. کروماتوگرافی کاغذی اکثرا به عنوان یک وسیله تحقیقاتی به کار می‌رود، و به طور گسترده‌ای در تجزیه‌های روزمره مخصوصا در جداسازی‌های جدیدی که هیچ روش کلاسیک برای آنها وجود ندارد، نیز مورد استفاده قرار می گیرد. روش اخیر در مسائل کلینیکی و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین کاربد دارد. آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند ، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسیدهای نوکلئیک ، جداسازی استرئیدها ، تجزیه عمومی ، تجزیه بسپارها ، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک ها و نمونه های زمین شناسیGeology ، بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی ، جداسازی آلکالوئیدها ، جداسازی ترکیبات علامت دار به وسیله رادیو ایزوتوپ‌ها ، کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مواد فرار غیر فعال مانند هیدروکربن‌ها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر مناسب نمی باشد.

داده ها:

داده های این آزمایش عبارتند از :

۱) رنگ های مشاهده شده برروی کاغذ کروماتوگرام

۲)  میزان  پیشروی نمونه برحسب میلی متر Dion

3)  میزان پیشروی حلال  Dsolvent

4) یافتن مقادیر Rf با استفاده از فرمول

شرح آزمایش :

1.       اول جعفری را به طور کامل می کوبیم وآن را در هاون با اتانول مخلوط می کنیم.

2.       با مزور cc5 اتر نفت در بشر می ریزیم.

3.       با مزور cc5 کلروفرم نیز در همان بشر می ریزیم.

4.       بر روی یک کاغذ صافی از انتها cm بالاتر خطی می کشیم.

5.       لوله مویین را در هاون می کنیم ونقطه ای از آب سبزی با اتانول مخلوط است بر وسط کاغذ می زنیم وسپس صبر می کنیم تا خشک شود.

6.       کاغذ صافی را در بشر محتوی حلال فرو می بریم و درآن را شیشه ساعت می بندیم تا بشر از بخار حلال پر شود.

7.       بعد از اینکه حلال دیگر در کاغذ صافی بالا نرفت آن را در می آوریم و خط حلال را بروی کاغذ صافی رسم می کنیم.

8.       fR  آن را حساب می کنیم.

9.       gr0.2 فنول متالین را با gr0.2 متیل اورانژ را نیز با  cc15 اتانول مخلوط می کنیم و در یک بشر می ریزیم.

10.   برای حلال نیز cc6 بوتانول و cc2 اتانول و cc2 آمونیاک درست می کنیمو

11.   لوله مویین را در بشر حاوی مخلوط می کنیم ونقطه ای از مخلوط بر وسط کاغذ می زنیم وسپس صبر می کنیم تا خشک شود.

12.   کاغذ صافی را در بشر حلال فرو می بریم و درآن را شیشه ساعت می بندیم تا بشر از بخار حلال پر شود.

13.   بعد از اینکه حلال در کاغذ صافی بالا نرفت آن را در می آوریم و خط حلال را بروی کاغذ صافی با مداد رسم می نماییم

14.   fR  کروماتوگرافی  را حساب می کنیم.

15.   مخلوطی از  gr0.2بنزوفنون وبنزیل الکل و cc15 اتانول را در یک بشر درست می کنیم.

16.   برای حلال نیز از cc5 کلروفرم و cc5 اتیل استات استفاده می کنیم.

17.   لوله مویین را در بشر مخلوط فرو می کنیم ونقطه ای بر وسط کاغذ می زنیم وسپس آن رادر کناری قرار می دهیم و صبر می کنیم تا خشک شود.

18.   کاغذ صافی را در بشر حلال فرو می بریم و درآن را شیشه ساعت می بندیم تا بشر از بخار حلال پر شود.

19.   بعد از چند دقیقه کاغذ صافی را از بشر در می آوریم و در ظرف ید فرو می بریم تا با بخار ید آشکار شود.

20.               fR  آن آزمایش  را حساب می کنیم.